細(xì)胞污染是細(xì)胞生物學(xué)實驗室中常見的情形。細(xì)胞污染通常分為微生物污染和真核生物污染。微生物污染指的是真菌、細(xì)菌、支原體等的污染。微生物污染容易辨識,可通過肉眼和利用顯微鏡觀察培養(yǎng)基的顏色變化進(jìn)行判斷。細(xì)菌污染通常使培養(yǎng)基變黃,且顯微鏡下有小黑點,酵母污染的培養(yǎng)基變紫色,顯微鏡下可見透明成串的圓形斑。但支原體污染較難看出,因為支原體的生長較慢,因此很容易被忽略。真核生物污染是由于實驗員操作不當(dāng)發(fā)生的細(xì)胞系之間的交叉污染。為避免細(xì)胞污染造成深遠(yuǎn)的影響,細(xì)胞鑒定萬不可少。
細(xì)胞系的鑒定主要圍繞四個方面進(jìn)行:
1、種系來源:常用技術(shù)包括STR分型,限制片段長度多態(tài)性(AFLP),染色體組分析,同工酶分析,人淋巴細(xì)胞抗原(HLA)分型。STR分型是重要的種系來源判斷手段。STR位點,又被稱為微衛(wèi)星,是3-7 bp的短串聯(lián)重復(fù)序列,具有高度多態(tài)性,被稱為細(xì)胞的DNA圖譜指紋,因此可以進(jìn)行STR分型,通過與專業(yè)數(shù)據(jù)庫比對,判斷樣本所屬細(xì)胞系。
2、組織來源:常用技術(shù)包括形態(tài)學(xué)手段、免疫組化分析。形態(tài)學(xué)手段是利用不同組織可能具有特殊的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)判斷組織來源。免疫組化是利用標(biāo)記的抗體定位組織特異性抗原來確定細(xì)胞的組織來源。
3、特異性功能檢測:根據(jù)細(xì)胞種類和功能,采用特異性指標(biāo)鑒定細(xì)胞。比如,腺細(xì)胞產(chǎn)生分泌蛋白或者激素。腫瘤細(xì)胞需要具備腫瘤組織的特性。
4、是否發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變:常用技術(shù)包括核型分析、細(xì)胞生長行為觀察(是否接觸抑制)、裸鼠成瘤實驗等。核型分析包括對染色體數(shù)目、形態(tài)、組成的研究,常用到染色體染色技術(shù)。核型分析可揭示染色體是否發(fā)生畸變、細(xì)胞功能、進(jìn)化活動和分裂關(guān)系。長期傳代可能會造成染色體畸變,因此需要定期檢查染色體核型。正常細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可能會轉(zhuǎn)化,獲得永生性或者惡型性。因此需要鑒定來區(qū)分正常細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞。
腫瘤細(xì)胞鑒定
對于腫瘤細(xì)胞,需要鑒定其是否保留腫瘤組織的特性,因此需要進(jìn)行一些鑒定步驟,包括集落形成實驗、成瘤性檢測和正常組織侵襲實驗等。
a. 細(xì)胞集落形成實驗:癌細(xì)胞株對培養(yǎng)條件的適應(yīng)性較強、獨立生存能力也較強,細(xì)胞集落率更高。因此可以通過測定細(xì)胞集落形成率,判斷細(xì)胞的生長能力,從而判定是否為無限細(xì)胞系。
b. 成瘤性檢測:將腫瘤細(xì)胞注射進(jìn)入裸鼠體內(nèi),檢測是否能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。
c. 正常組織侵襲實驗:該實驗是檢測腫瘤細(xì)胞是否對正常組織具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。
d. 其他:其他還包括對于密度依賴生長特性改變(接觸抑制)、分子水平特征的鑒定。接觸抑制是判定腫瘤和正常細(xì)胞的重要依據(jù)。
干細(xì)胞鑒定
干細(xì)胞的重點是檢測細(xì)胞的多能性。常規(guī)鑒定方法包括核型分析、擬胚體(EB)形成分析、三胚層分化檢測、堿性磷酸酶染色、多能性標(biāo)志物檢測和畸胎瘤檢測等。
a. EB分化檢測:EBs是人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的三維聚集物,即是干細(xì)胞多能性的標(biāo)志。EB分化檢測的流程是:將EB接種于含血清的培養(yǎng)基中自發(fā)分化,然后利用流式檢測三胚層表面標(biāo)志物,判定多能性。
b. 三胚層分化檢測:分別將胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向三胚層分化培養(yǎng),分別檢測特定胚層的標(biāo)志物,從而判斷其多能性。
c. 堿性磷酸酶(Ap)染色:未分化的干細(xì)胞會高水平表達(dá)Ap。通過對固定的干細(xì)胞染色,分化的細(xì)胞無色,未分化的細(xì)胞呈現(xiàn)紫色或者紅色。Ap染色是一種低成本、簡單快速的方法。
d. 多能性標(biāo)志物檢測:未分化狀態(tài)的ES和iPS能表達(dá)特定的表面標(biāo)志物,包括TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4、Nanog、SOX2、Oct4等。
e. 畸胎瘤檢測:將一定數(shù)量的干細(xì)胞注射進(jìn)入免疫缺陷小鼠體內(nèi), 4-12周后,多能干細(xì)胞能生成畸胎瘤。畸胎瘤包含了三個胚層的組織,可通過組織學(xué)手段檢測。但是該方法耗時費力,費用大。